MÉTODO EXPERIMENTAL

O que queremos comprobar é que a práctica é reproducible no noso laboratorio. Para iso, van preparar os patróns e mostras que logo se inxectarán no cromatógrafo líquido de alta resolución (HPLC), para adaptar o método cromatográfico ao noso equipo, que é un HPLC Agilent 1220 Infinity LC cunha columna Poroshell 120 de 4,6 x 100 mm e 2,7 µm de diámetro de partícula, un detector de lonxitude de onda variable e unha bomba binaria.

Preparación dos patróns de niacinamida

Prepárase unha disolución nai de niacinamida de 5000 ppm: pésanse 0,5 g de niacinamida e dilúense con auga de calidade HPLC nun matraz aforado de 100 mL.

A partir desta disolución nai, prepáranse diferentes disolucións patrón de niacinamida da seguinte maneira: en matraces aforados de 25 mL, engádese cunha micropipeta un volume determinado de disolución nai de niacinamida e dilúese con auga de calidade HPLC.

Táboa 1: Patróns de niacinamida

Con estes patróns construirase a recta de calibrado para determinar as concentracións de niacinamida nas mostras de crema facial.

Procedemento de extracción da niacinamida da crema facial

Neste experimento a niacinamida foi extraída da crema de día Olay Essentials utilizando como solvente unha solución de NaCl ao 20 % (m/V) e mediante dous métodos de extracción líquido-líquido diferentes para comparar os resultados:

• A) Método 1. Extracción líquido-líquido clásica

Neste tipo de extracción, despois de mesturar e axitar ben aproximadamente 0,2 g de crema con 5 mL do disolvente, centrifúgase 6 minutos a 6000 rpm, retírase a capa acuosa cunha xiringa e fíltrase o extracto acuoso cun filtro de celulosa de 0,22 µm.

• B) Método 2. Extracción líquido-líquido asistida por ultrasóns

Neste caso, despois de mesturar 0,2 g de crema con 10 mL do disolvente, sométese a mestura a sonicación nun baño de ultrasóns durante 20 minutos a temperatura ambiente, retírase a capa acuosa con xiringa e faise unha dobre filtración, primeiro cun filtro de nailon de 0,45 µm e despois cun filtro de celulosa de 0,22 µm.

No extracto acuoso obtido por calquera dos dous métodos, sepárase, identifícase e  cuantifícase niacinamida mediante HPLC en fase reversa, denominada así porque utiliza unha fase estacionaria apolar e unha fase móbil polar.

Mediante o método 1 a extracción é adecuada, pero a separación das fases non é moi nítida. Aínda así, cando se inxecta a mostra no HPLC, diluída adecuadamente, obtense un cromatograma idéntico ao da figura 1.

Ao noso entender, o problema da nitidez da separación das fases pode provocar unha perda de contido de niacinamida no extracto, co consecuente erro no resultado final da composición da mostra. Para evitar isto, optamos polo método 2, que é máis simple e no que non necesitamos unha separación nítida das fases.

Procedemento para separar e identificar a niacinamida mediante HPLC

Como a extracción non é específica, na fase acuosa poden estar presentes tamén outros ingredientes polares que conteña a crema facial, por iso é necesaria esta separación cromatográfica. Para decidir que tipo de elución imos utilizar para levar a cabo a separación cromatográfica, probamos dúas opcións:

• A) Elución en gradiente, con las siguientes condiciones:

Táboa 2. Condicións e elución en gradiente

Obtense o cromatograma que se mostra na figura 2.

Figura 2. Cromatograma dunha mostra de niacinamida en réxime de gradiente

• B) Elución isocrática, que se diferencia da anterior en que a fase móbil Metanol/H₂O ten unha composición constante ao longo de todo o proceso de 50/50 (%V/V).

En ambas as condicións se obtén unha boa separación e resolución do pico correspondente á niacinamida. Con todo, coa elución isocrática o tempo é sensiblemente menor e, polo  tanto, como unha das nosas máximas no ámbito académico é que se poida desenvolver unha práctica completa nun período non superior a 3-4 horas, decidímonos pola vía isocrática.

Para asegurarnos de cal é o pico correspondente á niacinamida, primeiramente inxectamos no aparello unha mostra patrón, co que comprobamos que, nestas condicións cromatográficas e co noso instrumento, o pico de niacinamida aparece aos 2,2 minutos:

Figura 3. Cromatograma dun patrón de niacinamida

Probamos o método cos extractos e efectivamente aparece o pico de niacinamida aos 2,2 min, ademais doutros picos que o acompañan, co que confirmamos que o método nos serve para separar a niacinamida doutros compoñentes da crema e tamén para identificala.

Figura 4. Cromatograma dunha mostra do extracto da crema

A maiores, fanse dúas comprobacións:

• 1. A ausencia do pico de niacinamida nun cromatograma dunha mostra de crema que non contén o analito.

No cromatograma da figura 5, ao inxectar unha mostra extraída e convenientemente diluída dunha crema sen analito desaparece o pico a 2,2 min do cromatograma.

Figura 5. Cromatograma dunha mostra do extracto da crema sen niacinamida

• 2. Efecto da composición, de distintas cremas, no cromatograma.

Realizamos unha proba con outra crema antiidade que tamén contén niacinamida, Miracle Skin Cream de Garnier, para comprobar se a composición de diferentes cremas pode afectar ao método de extracción. Os cromatogramas das figuras 6 e 7 mostran que non é así e concluímos que é posible utilizar a extracción por ultrasóns sen ningún problema.

Figura 6. Cromatograma dunha mostra do extracto da crema Olay

Figura 7. Cromatograma dunha mostra do extracto da crema Garnier

Vese que o pico da niacinamida para ambas as cremas aparece aproximadamente no mesmo tempo de retención. Tendo en conta todo o anterior, o método que eliximos para a determinación cuantitativa da niacinamida en cremas faciais é o seguinte:

Táboa 3. Condicións do método utilizado na nosa práctica

PROCEDEMENTO

Determinación cuantitativa da niacinamida

• Preparación da recta de calibrado

Inxéctase cada un dos patróns de niacinamida, preparados previamente, no equipo de HPLC, co método cromatográfico elixido, e obtéñense os seguintes resultados:

Táboa 4. Áreas dos patróns

Figura 8. Recta de calibrado

• Medida das mostras

Baseándonos no procedemento de extracción elixido, prepáranse tres mostras de aproximadamente 0,2 g de cada crema antiidade, Olay Essentials de Olay e Miracle Skin Cream de Garnier.

A continuación, tómanse cunha micropipeta 0,4 mL de cada extracto e introdúcense nun matraz aforado de 10 mL, engádese como disolvente a fase móbil ata rasar o matraz e homoxeneízase. Desta maneira temos a mostra o suficientemente diluída para que presente unha concentración similar á dos patróns usados para construír a recta de calibrado.

Inxéctanse no HPLC as tres mostras de Olay e obtéñense os seguintes resultados:

Táboa 5. Áreas das mostras de Crema Olay Essentials

O resultado da táboa indica que hai 377,8 mg en 1L, polo tanto, en 10 mL teremos 3,78 mg. Estes serán os que se extraeron da masa de mostra de 0,2 g. Así, a porcentaxe será: 3,8 niacinamida/200 mg mostra, é dicir, 1,9 % de niacinamida na crema Olay.

Facemos o mesmo coas tres réplicas de Garnier.

Táboa 6. Áreas e resultados das mostras de crema Garnier

O resultado indica que hai 559,2 mg en 1L, polo tanto, en 10 mL teremos 5,59 mg. Estes serán os que se extraeron da masa de mostra de 0,2 g. Así, a porcentaxe será: 4,59 niacinamida/200 mg mostra, é dicir, 2,3 % de niacinamida na crema Garnier.

Procedemento para os estudos de recuperación

Co fin de completar os nosos obxectivos, e dado que nos quedaba a dúbida de se a extracción era cuantitativa, decidimos facer un simple estudo de recuperación do analito en mostras convenientemente dopadas. Para iso adquiriuse unha crema Olay Total Effects 7 in One (imaxe 3) que non contén niacinamida e dopouse das seguintes formas:

• A) Dopaxe líquida

Pésanse aproximadamente 0,2 g de crema sen niacinamida nun vaso de 25 mL, engádense 10 mL de NaCl ao 20 % e 20 µL do patrón inicial de niacinamida de 5000 ppm. Deste xeito, teriamos unha mestura que contería aproximadamente 10 ppm de niacinamida.

Unha vez efectuada a extracción no baño de ultrasóns, filtraríase segundo o procedemento experimental e inxectaríase directamente no equipo de HPLC.

Os resultados para tres réplicas son:

Táboa 7. Áreas e resultados da mostra dopada de forma líquida

Como vemos na táboa, o resultado que ofrece a recuperación da mostra dopada de forma líquida, segundo a nosa recta de calibrado inicial, sería de 9,6 ppm (96 %), que desde logo é moi próxima ao valor teórico.

Figura 8. Cromatograma dunha mostra dopada de forma líquida

• B) Dopaxe sólida

Neste caso engádese 0,1 g de niacinamida pura sólida a 5 g de crema sen niacinamida nunha vía adecuada. Mestúrase homoxeneamente cunha microespátula colocando a vía durante 5 minutos no baño ultrasóns.

Imaxe 6. Mostra dopada de forma sólida

Desta mestura homoxénea pesaríanse 0,2 g nun vaso de precipitados de 25 mL, engadiríanse 10 mL de NaCl ao 20 % e procederíase á extracción da niacinamida no baño de ultrasóns durante 20 minutos. Filtraríase segundo o procedemento. Do filtrado tomaríanse 25 µL e rasaríase con auga ultrapura nun matraz de 10 mL. A inxección proporciónanos os seguintes resultados:

Táboa 8. Áreas e resultados da mostra dopada de forma sólida

Novamente podemos comprobar que a recuperación é próxima á teórica (94 %). Polo tanto, podemos concluír que o método de extracción por ultrasóns sería correcto para aplicalo ao caso de determinación de niacinamida en cremas faciais.

Figura 9. Cromatograma dunha mostra dopada de forma sólida

Conclusións

A nosa principal conclusión é que a práctica posta a punto no noso laboratorio e cos nosos equipos cumpre perfectamente os nosos obxectivos e os de calquera curso introdutorio de técnicas analíticas instrumentais:

• Utilización de mostras reais simples que aproximan o alumnado á práctica diaria dun laboratorio.
• Introdución ao tratamento e preparación de mostra previos á análise instrumental.
• Utilización por parte do alumnado de equipos de certa complexidade, logrando que se familiaricen e que perdan “o medo” a técnicas instrumentais habituais en laboratorios de análises.
• Utilización de ferramentas básicas para a obtención, rexistro e interpretación de resultados.